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前言

維生素B1又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎維生素或抗腳氣病維生素，由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過(guò)亞甲基結(jié)合而成的一種B族維生素。維生素B1主要存在于種子的外皮和胚芽中，如米糠和麩皮中含量很豐富，在酵母菌中含量也極豐富。瘦肉、白菜和芹菜中含量也較豐富。所用的維生素B1都是化學(xué)合成的產(chǎn)品。在體內(nèi)，維生素B1以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用；還能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，增加食欲。維生素B1缺乏時(shí)，可引起多種神經(jīng)炎癥，如腳氣病。維生素B1缺乏所引起的多發(fā)性神經(jīng)炎，患者的周圍神經(jīng)末梢有發(fā)炎和退化現(xiàn)象，并伴有四肢麻木、肌肉萎縮、心力衰竭、下肢水腫等癥狀。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上，維生素B1制劑治療腳氣病和多種神經(jīng)炎癥有顯著療效。

實(shí)驗(yàn)部分

儀器、試劑與材料

主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器

試劑材料

正丁醇、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸鈉、氯化鈣均為分析純；

冰乙酸、甲醇為色譜純

維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：鹽酸硫胺素，CAS 67-03-8；

木瓜蛋白酶：應(yīng)不含維生素B1，酶活力≥800 U（活力單位）/mg；

淀粉酶：應(yīng)不含維生素B1，酶活力≥3700 U/g；

20 g/L鐵氰化鉀溶液：稱取2 g鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL，搖勻；

100 g/L氫氧化鈉溶液：稱取25 g氫氧化鈉，用水溶解并定容至250 mL，搖勻；

堿性鐵氰化鉀溶液：將5 mL上述鐵氰化鉀溶液與200 mL上述氫氧化鈉溶液混合，搖勻；

0.1 mol/L鹽酸溶液：移取8.5 mL鹽酸，加水稀釋至1000 mL，搖勻；

0.01 mol/L鹽酸溶液：量取0.1 mol/L鹽酸溶液50 mL，用水稀釋并定容至500 mL，搖勻；

0.05 mol/L乙酸鈉溶液：稱取6.08 g乙酸鈉，加900 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.0 ~ 5.0之間，加水定容至1000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后使用；

2.0 mol/L乙酸鈉溶液：稱取27.2 g乙酸鈉，用水溶解并定容至100 mL，搖勻；

混合酶溶液：稱取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 mL，渦旋，使呈混懸狀液體，冷藏保存。

樣品制備

樣品提取

稱取3 g ~ 5 g固體試樣或者10 g ~ 20 g液體試樣于100 mL錐形瓶中（帶有軟質(zhì)塞子），加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，高壓滅菌鍋中121℃保持30 min。水解結(jié)束待冷卻至40℃取出，輕搖數(shù)次，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0左右，加入2 mL（可根據(jù)酶活力不同適當(dāng)調(diào)整用量）混合酶溶液，搖勻后，置于培養(yǎng)箱中37℃過(guò)夜（約16 h），將酶解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，離心或者過(guò)濾，取上清液備用。

樣品衍生化

準(zhǔn)確移取上述上清液或者濾液2 mL于10 mL試管中，加入1 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后，準(zhǔn)確加入2 mL正丁醇，再次渦旋混勻1.5 min后靜置約10 min或者離心，待充分分層后，吸取正丁醇相（上層）經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液于2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，待檢測(cè)。若樣品中維生素B1濃度超出線性范圍的最高濃度值，應(yīng)取上清液稀釋適宜倍數(shù)后，重新衍生后進(jìn)樣。

實(shí)驗(yàn)條件

液相條件

色譜柱：Venusil® XBP C18(2)  5 μm， 4.6 × 250 mm，100 ?

流動(dòng)相：0.05 mol/L乙酸鈉溶液︰甲醇 = 65︰35

熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)375 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435 nm

流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)圖1、圖2可知，采用Venusil XBP C18(2)色譜柱檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1，峰形良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液

圖2 嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)GB 5009.84-2016第一法，用Venusil XBP C18(2)（5 μm，100 ?，4.6 × 250 mm）檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的維生素B1，并結(jié)合液相色譜-熒光檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果維生素B1保留時(shí)間穩(wěn)定，峰形良好，說(shuō)明Venusil XBP C18(2)（5 μm，100 ?，4.6 × 250 mm）能夠用于嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

按照國(guó)標(biāo)法進(jìn)行樣品前處理時(shí)回收率較低，可采用先熱超聲提取，再經(jīng)過(guò)酸沉淀蛋白后直接衍生化的方法加以改善。熱超聲時(shí)要注意溫度的控制，以防止維生素B1遭到破壞。

因維生素B1為強(qiáng)極性化合物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意流動(dòng)相比例的確定，且流動(dòng)相的pH對(duì)出峰時(shí)間影響較大，因此在每次開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，要調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值到相同的值。

附：相關(guān)產(chǎn)品

應(yīng)用編號(hào)：AF10010