河北來復醫(yī)藥科技有限公司
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糖皮質激素是臨床常用的一類藥物，對皮膚病有良好的消炎作用，可抑制纖維細胞增生，減少5-羥色胺的形成，因此其在短時間使用對皮膚有一定的嫩白作用【1】。但長期使用則會發(fā)生皮膚變薄、毛細血管擴張、毛囊萎縮，一旦停用，皮膚就會發(fā)紅、發(fā)癢，出現(xiàn)紅斑、皮疹等。因此我國《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》【2】明確規(guī)定此類物質為禁用成分。目前糖皮質激素的檢測多集中在藥品中有效成分和尿液中糖皮質激素的檢測【3-7】，化妝品中糖皮質激素的檢測文獻報道的較少。本文采用CLearnert PEP-2 SPE凈化的方法，建立了一種化妝品中潑尼松、潑尼松龍、可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、倍他米松、地塞米松、醋酸可的松、醋酸潑尼松、醋酸氫化可的松、曲安奈德11種糖皮質激素同時檢測的方法。
實驗方法
.實驗試劑和材料
糖皮質激素類藥物標準品（詳見表1）
表1 糖皮質激素類藥物標準品信息
|
中文名 |
英文名 |
CAS號 |
相對分子質量 |
|
潑尼松龍 |
Prednisone |
50-24-8 |
360.1937 |
|
氫化可的松 |
Hydrocortisone |
50-23-7 |
362.2093 |
|
潑尼松 |
Prednisone |
53-03-2 |
358.1780 |
|
可的松 |
Cortisone |
53-06-5 |
360.1937 |
|
甲基潑尼松龍 |
MethyLprednisoLone |
83-43-2 |
374.2093 |
|
倍他米松 |
Betamethasone |
378-44-9 |
392.1999 |
|
地塞米松 |
Dexamethasone |
50-02-2 |
392.1999 |
|
曲安奈德 |
TriamcinoLone acetonide |
76-25-5 |
434.2105 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
Hydrocortisone 21-acetate |
50-03-3 |
404.2200 |
|
潑尼松醋酸酯 |
Prednisone 21-acetate |
125-10-0 |
400.1886 |
|
可的松醋酸酯 |
Cortisone 21-acetate |
50-04-4 |
402.2042 |
實驗試劑（詳見表2）
|
試劑名稱 |
品牌 |
規(guī)格 |
|
甲醇 |
霍尼韋爾 |
質譜純，2.5L/瓶 |
|
乙腈 |
霍尼韋爾 |
質譜純，2.5L/瓶 |
|
水 |
霍尼韋爾 |
質譜純，2.5L/瓶 |
儀器和設備（詳見表3）
|
設備名稱 |
品牌 |
規(guī)格/型號 |
|
串聯(lián)質譜儀 |
AB SCIEX |
API 4000+ |
|
高效液相色譜儀 |
安捷倫 |
1260 |
|
VenusiLTM ASB C18液相色譜柱 |
天津博納艾杰爾科技 |
2.1×150mm 3μm 150A |
|
分析型柱溫箱 |
天津博納艾杰爾科技 |
>室溫5℃~70℃ |
|
12位固相萃取裝置 |
天津博納艾杰爾科技 |
12位 |
|
CLeanertTM PEP-2 固相萃取小柱 |
天津博納艾杰爾科技 |
500 mg/6 mL |
|
針式過濾器（尼龍） |
天津博納艾杰爾科技 |
0.22 um，13 mm |
|
分析天平 |
賽多利斯 |
0.1mg，220g |
|
高速離心機 |
上海華亭 |
50mL*6 |
|
渦旋振蕩器 |
Vortex-genie |
230/240VAC 50HZ |
|
氮吹儀 |
天津博納艾杰爾科技 |
15位 |
糖皮質激素類藥物標準溶液配制
標準貯備液
分別精密稱取適量的12種糖皮質激素標準品，用甲醇溶解定容，分別配制成1 000μg/mL的貯備液。-20℃以下保存。
混合標準工作液
準確量取糖皮質激素類藥物標準貯備液適量，用20%乙腈水溶液稀釋成適宜濃度的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
實驗試劑的配置
10%亞鐵氰化鉀溶液：稱量2.3g K4Fe(CN)6?3H2O，用水溶解定容至20mL；
20%乙酸鋅溶液：稱量4.78g C4H6O4Zn?2H2O，用水溶解定容至20mL；
定容液：量取70mL水和30mL乙腈，混勻后加入100uL甲酸混勻。
測定步驟
提取
霜膏類化妝品：稱取0.2 g試樣于50mL離心管，混勻。加入3 mL飽和氯化鈉溶液，渦旋混合使樣品分散，加入2mL乙腈，超聲提取5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上層清液于另一50 mL離心管中，下層氯化鈉溶液用2mL乙腈重復提取一次，合并二次乙腈提取液，往提取液加入40mL去離子水，混勻，加入亞鐵氰化鉀溶液0.2mL，混勻，加入乙酸鋅溶液0.2mL，混勻，8000r/min離心10min，作為待進化液。
精油類樣品：稱取0.5g試樣（精確至0.01g）于50 mL離心管，混勻。加入4 mL正己烷，渦旋混合使樣品分散，加入4 mL 50%乙腈水溶液，渦旋提取2 min，8000 r/min離心5min，吸取下層提取液，上層正己烷用4 mL 50%乙腈水溶液重復上述提取步驟一次，合并二次50%乙腈提取液，往提取液加入36 mL去離子水，混合，加入亞鐵氰化鉀溶液0.1mL，混勻，加入乙酸鋅溶液0.1mL，混勻，8000r/min離心10 min，作為待進化液。
凈化
將PEP-2固相萃取小柱接上固相萃取裝置，小柱上端緊密連接一個60 mL裝有篩板的上樣管，小柱預先用5 mL甲醇、10 mL水活化。將上述待凈化液全部上樣，待樣品溶液自然流盡后，再用10 mL 10%乙腈水溶液淋洗小柱，待清洗液自然流盡后，取下上樣管，用吸球吹出小柱中的殘留液。用6mL甲醇洗脫小柱，待甲醇自然流盡后，用吸球吹出小柱中的殘留液，收集洗脫液于40℃氮氣吹干，用1 mL定容液溶解定容，過0.22 um尼龍濾膜，待測。
液相色譜條件
色譜柱：VenusiL ASB C18，3μm，150 ?，2.1*150mm；
流動相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的乙腈溶液；
梯度洗脫程序見表4；
柱溫：30℃；
進樣量：10μL。
表4 流動相梯度洗脫條件和流速
|
時間/min |
流速/μL/min |
A相/% |
B相/% |
|
0.00 |
200 |
68 |
32 |
|
3.00 |
200 |
68 |
32 |
|
10.00 |
200 |
25 |
75 |
|
15.00 |
200 |
15 |
85 |
|
15.01 |
200 |
68 |
32 |
|
25.00 |
200 |
68 |
32 |
質譜條件
離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；
IS：-4500V；
GS1：55Psi；
GS2：55Psi；
TEM：550℃；
糖皮質激素類藥物多反應監(jiān)測的優(yōu)化參數(shù)見表5。
表5 糖皮質激素類藥物多反應監(jiān)測的優(yōu)化參數(shù)
|
藥物名稱 |
保留時間/min |
監(jiān)測離子對 |
DP |
EP |
CE |
CXP |
|
潑尼松龍 |
6.22 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
氫化可的松 |
6.35 |
407.2/331.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
407.2/361.1 |
-30 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
潑尼松 |
6.29 |
403.1/326.9 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
403.1/357.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松 |
6.66 |
405.1/329.1 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
|
|
405.1/359.2 |
-40 |
-10 |
-20 |
-9 |
|
甲基潑尼松龍 |
9.02 |
419.2/343.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
|
|
419.2/373.0 |
-40 |
-10 |
-22 |
-9 |
|
倍他米松 |
9.55 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
地塞米松 |
10.04 |
437.2/361.3 |
-60 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
|
|
437.2/391.1 |
-65 |
-10 |
-22 |
-1 |
|
曲安奈德 |
12.22 |
479.1/413.4 |
-60 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
|
|
479.1/337.1 |
-40 |
-10 |
-24 |
-11 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
12.9 |
449.2/403.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
|
|
449.2/373.0 |
-50 |
-10 |
-16 |
-11 |
|
潑尼松醋酸酯 |
13.42 |
447.2/401.1 |
-45 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
|
|
447.2/371.2 |
-50 |
-10 |
-18 |
-9 |
|
可的松醋酸酯 |
12.30 |
445.2/339.1 |
-40 |
-10 |
-16 |
-9 |
|
|
|
445.2/369.3 |
-45 |
-10 |
-16 |
-9 |
注：帶"____"的監(jiān)測離子對為定量離子對。
結果與討論
凈化條件的選擇
目前文獻報道的凈化方法多選用聚合物基質的吸附性材料或硅膠基質的ODS SPE小柱。本文選用CLeanert PEP-2 SPE小柱，實驗結果表明其可同時對11種糖皮質激素有很好的吸附。
考察了不同體積分數(shù)0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%乙腈的水溶液的洗脫效果，結果表明使用10%乙腈的水溶液，可保證11種糖皮質激素不被洗脫下來，所以最終選用10%乙腈的水溶液做淋洗液，并且在上樣之前要用水將乙腈的提取液稀釋。
液相色譜柱的選擇
在本文要同時檢測的11種糖皮質激素中，可的松和氫化可的松、倍他米松和地塞米松為同分異構體，在反相液相色譜中比較難分離。通過比較不同C18的分離效果，最終選用VenusiLASB C18（3μm，150?，2.1 × 150mm）為色譜柱，可保證11種糖皮質激素在15min內均達到基線分離。
線性關系和檢出限
將濃度分別為2、5、10、20和50μg/L的混合標準溶液依次進樣分析，以峰面積Y對濃度X（μg/L）擬合回歸方程，結果見表6。結果表明，11種糖皮質激素分別在2-50μg/L范圍內呈線性，相關系數(shù)r大于0.999，檢出限（S/N=3）為
表6 11種糖皮質激素線性回歸方程和檢出限
|
藥物名稱 |
線性方程 |
r |
|
潑尼松 |
Y=16724X-210.43 |
0.9991 |
|
潑尼松龍 |
Y=23142-11999 |
0.9992 |
|
可的松 |
Y=16727-9533.1 |
0.9998 |
|
氫化可的松 |
Y=11244X+692.17 |
0.9992 |
|
甲基潑尼松龍 |
Y=16312X-15347 |
0.9992 |
|
倍他米松 |
Y=10695X-6738.1 |
0.9994 |
|
地塞米松 |
Y=22636-9558 |
0.9994 |
|
可的松醋酸酯 |
Y=8486.7X+2690.1 |
0.9994 |
|
潑尼松醋酸酯 |
Y=10652X-7839.4 |
0.9997 |
|
氫化可的松醋酸酯 |
Y=4372X-2405.8 |
0.9995 |
|
曲安奈德 |
Y=4062.9X-29840 |
0.9992 |
準確度和重現(xiàn)性
以市售玫瑰精油和護手霜為基質，進行添加回收實驗，進行0.1μg/g和0.05μg/g添加濃度的實驗，11種糖皮質激素的回收率均在75%-120%之間，具體實驗結果請見下列表格：
表7 玫瑰精油0.1μg/g添加回收實驗結果
|
藥物名稱 |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
潑尼松 |
85.19% |
85.65% |
76.98% |
82.61% |
5.90% |
|
潑尼松龍 |
91.68% |
90.70% |
81.07% |
87.82% |
6.68% |
|
可的松 |
93.67% |
92.11% |
82.38% |
89.39% |
6.84% |
|
氫化可的松 |
84.56% |
89.38% |
86.89% |
86.94% |
2.77% |
|
甲基潑尼松龍 |
94.08% |
82.90% |
84.75% |
87.24% |
6.87% |
|
倍他米松 |
89.74% |
90.28% |
80.51% |
86.84% |
6.33% |
|
地塞米松 |
103.10% |
93.90% |
89.10% |
95.37% |
7.46% |
|
可的松醋酸酯 |
87.19% |
87.40% |
92.02% |
88.87% |
3.07% |
|
潑尼松醋酸酯 |
119.07% |
119.86% |
111.63% |
116.85% |
3.89% |
|
氫化可的松醋酸酯 |
91.12% |
91.69% |
87.43% |
90.08% |
2.57% |
|
曲安奈德 |
98.72% |
84.57% |
87.15% |
90.14% |
8.36% |
表8玫瑰精油0.05μg/g添加回收實驗結果表
|
藥物名稱 |
平行1 |
平行2 |
平行3 |
平均回收率 |
RSD |
|
潑尼松 |
78.32% |
75.44% |
86.69% |
80.15% |
7.29% |
|
潑尼松龍 |
85.75% |
85.75% |
86.16% |
85.88% |
0.28% |
|
可的松 |
86.99% |
77.29% |
88.46% |
84.25% |
7.20% |
|
氫化可的松 |
72.36% |
69.15% |
75.04% |
72.18% |
4.08% |
|
甲基潑尼松龍 |
84.80% |
88.74% |
99.95% |
91.16% |
8.62% |
|
倍他米松 |
76.19% |
85.32% |
95.32% |
85.61% |
11.18% |
|
地塞米松 |
80.38% |
79.99% |
90.64% |
83.67% |
7.22% |
|
醋酸酯可的松 |
86.52% |
93.17% |
107.36% |
95.68% |
11.13% |
|
潑尼松醋酸酯 |
119.39% |
107.72% |
111.49% |
112.87% |
5.28% |
|
氫化可的松醋酸酯 |
94.54% |
110.02% |
103.75% |
102.77% |
7.58% |
|
曲安奈德 |
94.10% |
73.98% |
90.74% |
86.27% |
12.49% |
|
|
|
|
|
|
|
9護手霜0.1μg/g添加回收實驗結果
實驗結論
使用CLeanertTM PEP-2、VenusiLTM ASB C18建立了一種化妝品中11種糖皮質激素同時檢測的分析方法，實驗結果表明本方法快速、準確，可用于化妝品中糖皮質激素的檢測。
參考文獻
【1】鄭星泉，周淑玉，周世偉?；瘖y品衛(wèi)生檢驗手冊。北京：化學工業(yè)出版社，2003.294
【2】化妝品衛(wèi)生規(guī)范。2007.34
【3】左志輝，周建玉，左文堅。藥物分析雜志。2004,24（4）：420
【4】張林，孫子林。中國藥物與臨床。2006,6（1）：76
附圖
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