河北來復(fù)醫(yī)藥科技有限公司
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背景
溶血磷脂酰膽堿（lyso-Phosphatidylcholines,LPCs）是磷脂的一種，具有多種生理功能，與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關(guān)。LPCs主要在肝臟代謝，在肝臟疾病和肝毒性中可發(fā)生明顯變化；近年來，學(xué)者們對(duì)多種肝臟疾病和化學(xué)性肝毒性模型的大量研究均涉及了LPCs。
本應(yīng)用案例介紹一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，采用Cleanert PPT 96孔板凈化人血清樣品，從血清樣品中富集LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五種溶血磷脂酰膽堿，該方法具有良好的穩(wěn)定性及可靠性，可為溶血磷脂酰膽堿臨床研究提供一種解決方案。
材料及儀器
Cleanert PPT 蛋白沉淀板，Cleanert M96 生物樣品前處理儀，Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀，96孔收集板，Durashell C18(L)（3.0*50 mm, 5 μm,150?），以上產(chǎn)品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；LC-MS/MS, API 4000+（SCIEX）；LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0（以上5種標(biāo)準(zhǔn)品購自Avanti）；利血平(內(nèi)標(biāo))；甲醇；甲酸；水；生理鹽水（0.9%）；甲酸銨。
樣品處理方法
樣品混合
由于難以獲得不含目標(biāo)物的基質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)使用生理鹽水代替人血清進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)。為保護(hù)人血中溶血磷脂酰膽堿，試驗(yàn)中使用的甲醇均含有0.1% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）。
標(biāo)準(zhǔn)曲線及重現(xiàn)性試驗(yàn)中，基質(zhì)為生理鹽水，試驗(yàn)中取20μL生理鹽水，加入5μL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混合均勻，待下一步凈化。
人血清加標(biāo)試驗(yàn)中，取20μL血清，加入5μL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混合均勻，待下一步凈化。
蛋白沉淀過程
先向Cleanert PPT每孔中加入150μL甲醇（含100ppb利血平），再加入預(yù)混合的樣品，渦旋混合均勻，靜置10min，使用Cleanert M96將溶液收集至潔凈收集板內(nèi)。
Cleanert V96溫度設(shè)定為30℃，將收集板里的溶液氮吹干，使用1mL 80%甲醇水復(fù)溶，渦旋混合均勻，進(jìn)樣測(cè)試。
儀器檢測(cè)條件
HPLC條件
色譜柱：Durashell C18(L) （3.0*50mm 5um 150?）
流速：800uL/min
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：5 μL
流動(dòng)相條件
|
Total Time(min) |
0.1%甲酸25mM甲酸銨-水 (%) |
0.1%甲酸-甲醇(%) |
|
0 |
70 |
30 |
|
0.5 |
50 |
50 |
|
1 |
0 |
100 |
|
4 |
0 |
100 |
|
4.1 |
70 |
30 |
|
5 |
STOP |
|
質(zhì)譜條件
掃描模式：電噴霧電離正模式
采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）
表2 參數(shù)信息
|
目標(biāo)物 |
tR/min |
Q1 |
Q3 |
DP |
CE |
|
利血平 |
2 |
609.3 |
448.2 |
140 |
40 |
|
609.3 |
195* |
120 |
45 |
||
|
C14:0 |
2.46 |
468.4 |
285.3 |
110 |
40 |
|
468.4 |
450.4* |
120 |
27 |
||
|
C15:0 |
2.54 |
482.3 |
299.5 |
120 |
36 |
|
482.3 |
464.2* |
120 |
28 |
||
|
C16:0 |
2.63 |
496.4 |
478.2* |
124 |
16 |
|
C17:0 |
2.72 |
510.4 |
327.2 |
120 |
30 |
|
510.4 |
492.4* |
120 |
20 |
||
|
C18:0 |
2.83 |
524.5 |
341.5 |
115 |
28 |
|
524.5 |
506.2* |
127 |
18 |
注：*為定量離子對(duì)
結(jié)果
線性范圍與靈敏度為考察方法線性范圍，配置系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，取5μL標(biāo)準(zhǔn)工作液至20μL生理鹽水中進(jìn)行前處理操作，獲得的樣品濃度參見 3中S1~S7，曲線方程等信息參見表3.
表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度及線性關(guān)系
|
項(xiàng)目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
S1/ppm |
0.125 |
0.25 |
3.75 |
0.375 |
2.5 |
|
S2/ppm |
0.25 |
0.5 |
7.5 |
0.75 |
5 |
|
S3/ppm |
0.5 |
1 |
15 |
1.5 |
10 |
|
S4/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
S5/ppm |
2.5 |
5 |
75 |
7.5 |
50 |
|
S6/ppm |
3.75 |
7.5 |
112.5 |
11.25 |
75 |
|
S7/ppm |
7.5 |
15 |
225 |
22.5 |
150 |
|
曲線方程 |
y=0.725x+0.00264 |
y=0.212x-0.0256 |
y=0.212x+0.268 |
y=0.366x+0.00653 |
y=0.31x+0.287 |
|
相關(guān)系數(shù) |
0.9965 |
0.9913 |
0.9956 |
0.9938 |
0.9961 |
|
LOQ/ppm |
0.027 |
0.12 |
0.32 |
0.059 |
0.072 |
方法精密度與準(zhǔn)確度
實(shí)驗(yàn)中取生理鹽水為基質(zhì)，進(jìn)行兩個(gè)濃度（S3，S5）的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行兩個(gè)平行樣，結(jié)果見表4.
為考察方法精密度與準(zhǔn)確度，取濃度水平為S3與S5分別進(jìn)行8個(gè)樣品的平行試驗(yàn)，S3對(duì)應(yīng)LQC，S5對(duì)應(yīng)HQC，基質(zhì)為生理鹽水，實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)見表5。
表4 生理鹽水基質(zhì)加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)
|
項(xiàng)目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
低加標(biāo)濃度/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
高加標(biāo)濃度/ppm |
3.75 |
7.5 |
113 |
11.3 |
75 |
|
低-實(shí)測(cè)濃度-1/ppm |
1.29 |
2.28 |
38.1 |
3.31 |
24.3 |
|
低-實(shí)測(cè)濃度-2/ppm |
1.44 |
2.85 |
43 |
4.09 |
28.1 |
|
低-回收率-1 |
103.2% |
91.2% |
101.6% |
88.3% |
97.2% |
|
低-回收率-2 |
114.4% |
114.0% |
114.7% |
109.1% |
112.4% |
|
高-實(shí)測(cè)濃度-1/ppm |
3.44 |
6.77 |
102 |
9.83 |
69.9 |
|
高-實(shí)測(cè)濃度-2/ppm |
3.35 |
6.53 |
103 |
9.94 |
69 |
|
高-回收率-1 |
91.7% |
90.3% |
90.3% |
87.0% |
93.2% |
|
高-回收率-2 |
89.3% |
87.1% |
91.2% |
88.0% |
92.0% |
表5 生理鹽水基質(zhì)精密度與準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)
|
項(xiàng)目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
LQC平均回收率(n=8) |
96.3% |
99.9% |
103.6% |
96.6% |
100.0% |
|
CV(n=8) |
6.3% |
6.4% |
8.5% |
7.1% |
7.0% |
|
HQC平均回收率(n=8) |
96.8% |
99.1% |
97.5% |
93.8% |
97.7% |
|
CV(n=8) |
11.3% |
12.1% |
12.3% |
12.0% |
11.3% |
由表4及表5可見，此方法可用于處理及檢測(cè)生理鹽水基質(zhì)中的溶血磷脂酰膽堿，為進(jìn)一步考察方法對(duì)于血清樣本的適應(yīng)性，特取人血清進(jìn)行加標(biāo)回收率考察，獲得數(shù)據(jù)見表6.由于人血清中含有濃度可觀的溶血磷脂酰膽堿，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩份人血清樣品用于扣除內(nèi)源性溶血磷脂酰膽堿，加標(biāo)回收率計(jì)算公式為：
CA—加標(biāo)樣實(shí)測(cè)濃度
CM—人血清樣品平均濃度
CS—加標(biāo)濃度
表6 人血清基質(zhì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
|
項(xiàng)目 |
C14:0 |
C15:0 |
C16:0 |
C17:0 |
C18:0 |
|
低加標(biāo)濃度/ppm |
1.25 |
2.5 |
37.5 |
3.75 |
25 |
|
高加標(biāo)濃度/ppm |
3.75 |
7.5 |
113 |
11.3 |
75 |
|
人血清樣品-1/ppm |
0.827 |
2.46 |
107 |
2.92 |
47.3 |
|
人血清樣品-2/ppm |
0.678 |
2.21 |
92 |
2.45 |
39.4 |
|
低-實(shí)測(cè)濃度-1/ppm |
1.97 |
4.5 |
140 |
6.24 |
72 |
|
低-實(shí)測(cè)濃度-2/ppm |
2.17 |
4.99 |
136 |
6.67 |
70 |
|
低-回收率-1 |
97.4% |
86.6% |
108.0% |
94.8% |
114.6% |
|
低-回收率-2 |
113.4% |
106.2% |
97.3% |
106.3% |
106.6% |
|
高-實(shí)測(cè)濃度-1/ppm |
4.8 |
9.46 |
196 |
13.8 |
113 |
|
高-實(shí)測(cè)濃度-2/ppm |
4.72 |
9.69 |
216 |
14.8 |
122 |
|
高-回收率-1 |
107.9% |
95.0% |
85.4% |
98.4% |
92.9% |
|
高-回收率-2 |
105.3% |
98.1% |
103.1% |
107.2% |
104.9% |
圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線S2點(diǎn)色譜圖
圖2 人血樣品色譜圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本應(yīng)用使用蛋白沉淀的方式對(duì)生理鹽水及人血清進(jìn)行前處理，并使用LC-MS/MS檢測(cè)溶血磷脂酰膽堿，結(jié)果表明本方法簡單、穩(wěn)定、易操作，可快速處理檢測(cè)人血清中溶血磷脂酰膽堿含量，用于臨床研究。
實(shí)驗(yàn)所用產(chǎn)品列表
|
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格/包裝 |
訂貨號(hào) |
|
Cleanert PPT |
96孔板，1mL/well |
96CD1025-M |
|
Cleanert M96 生物樣品前處理儀 |
與96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀 |
與96孔板匹配 |
NV-96G |
|
96孔收集板 |
2mL/well，與96孔板匹配 |
96SP2036-Y |
|
Durashell C18(L) |
3.0*50mm，5μm，150? |
DC950503-L |
|
甲醇 |
LC-MS級(jí), 4*2.5L |
LC230 |
|
水 |
LC-MS級(jí)，4*2.5L/箱 |
LC365 |
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