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血清中類固醇激素的檢測(cè)-Cleanert SLE

發(fā)布日期:2019-03-29

?類固醇激素又稱為甾體激素，是內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的高效能生物化學(xué)物質(zhì)。它們?cè)诰S持生命、調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝、促進(jìn)性器官發(fā)育和維持生育等方面起著重要作用。

類固醇激素在體內(nèi)的含量較低，對(duì)其準(zhǔn)確定量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用Cleanert SLE對(duì)血清樣品進(jìn)行凈化，建立了血清中類固醇激素的檢測(cè)方法，可為臨床研究提供參考。

目標(biāo)物信息

表1 目標(biāo)物結(jié)構(gòu)信息

名稱	CAS	結(jié)構(gòu)
可的松	53-06-5
黃體酮	57-83-0
睪酮	58-22-0
勃地酮	846-48-0

材料

Cleanert SLE (200mg/3mL)；Cleanert M96 生物樣品前處理儀；Cleanert V96 氮吹濃縮儀；Venusil ASB C18（2.1*50mm，3μm,150 ?）；API 4000+。

樣品處理方法

移取200μL血清樣品至樣品管中，并加入一定體積的甲醇，使溶液中甲醇的含量為5%，搖勻待凈化。

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的血清樣品上樣至Cleanert SLE中，可開啟負(fù)壓裝置(真空度＜-0.04MPa)將樣品抽過(guò)上篩板或使用Cleanert M96 生物樣品前處理儀將樣品壓下篩板，待樣品全部流至填料中后，靜止10min。

在每孔中加入600μL甲基叔丁基醚(MTBE)用于目標(biāo)物的洗脫，控制洗脫速度為1~2mL/min，在第一次洗脫完成之后，間隔1min再進(jìn)行第二次洗脫，合并洗脫液。

將合并的洗脫液用96位氮吹儀進(jìn)行氮吹濃縮，溫度設(shè)定為40℃，氮吹至近干。

使用200μL乙腈/水（3/7，v/v）將樣品進(jìn)行重溶，搖勻，進(jìn)樣檢測(cè)。

儀器檢測(cè)條件

正模式方法（針對(duì)黃體酮、睪酮、勃地酮）

HPLC條件

色譜柱：Venusil ASB C18（2.1*50mm，3μm,150 ?）

流速：200μL/min

柱溫：30℃

進(jìn)樣量：5μL

流動(dòng)相：水/乙腈（45/55，v/v）

質(zhì)譜條件

掃描模式：電噴霧電離正模式

采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）

表2 質(zhì)譜參數(shù)

ID	保留時(shí)間/min	Q1	Q3	DP	CE
勃地酮	1.66	287.3	121.3	110	30
勃地酮	1.66	287.3	135.3	109	24
睪酮	1.95	289.3	97.1	114	30
睪酮	1.95	289.3	109.2	115	36
黃體酮	4.16	315.4	97.1	95	35
黃體酮	4.16	315.4	109.1	95	39

負(fù)模式方法（針對(duì)可的松）

HPLC條件

色譜柱：Venusil ASB C18（2.1*50mm，3μm,150 ?）

流速：200μL/min

柱溫：30℃

進(jìn)樣量：5μL

流動(dòng)相：水/乙腈（70/30，v/v）

質(zhì)譜條件

掃描模式：電噴霧電離負(fù)模式

采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）

表3 質(zhì)譜參數(shù)

ID	保留時(shí)間/min	Q1	Q3	DP	CE
可的松	2.55	405.3	359	-60	-12
		405.3	328.8	-40	-18
		405.3	300.9	-55	-26

結(jié)果

表4 數(shù)據(jù)結(jié)果

化合物	加標(biāo)回收率-1	加標(biāo)回收率-2	LOD/ng/mL
黃體酮	67.90%	63.48%	0.15
睪酮	86.94%	78.57%	0.04
勃地酮	97.78%	94.07%	0.12
可的松	103.53%	107.69%	0.02

圖1 可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（濃度為5 ng/mL）

圖2 勃地酮、睪酮與黃體酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（濃度為5 ng/mL）

圖3 血清樣品色譜圖（負(fù)模式）

圖4 血清樣品色譜圖（正模式）

圖5 血清加標(biāo)樣色譜圖（負(fù)模式-加標(biāo)濃度為5ng/mL）

圖6 血清加標(biāo)樣色譜圖（正模式-加標(biāo)濃度為5ng/mL）

訂貨信息表

產(chǎn)品名稱	規(guī)格/包裝	訂貨號(hào)
Cleanert SLE	96深孔板，200mg/3mL	HC2003-9
96孔板負(fù)壓裝置	與96孔板匹配	VM96
Cleanert M96 生物樣品前處理儀	與96孔板匹配	SPE-M96
Cleanert V96 氮吹濃縮儀	與96孔板匹配	NV96-G
96孔接收板	2mL/well，與96孔板匹配	96SP2036-2
Venusil ASB C18	2.1*50mm，3μm,150 ?	VS930502-0
乙腈	HPLC, 4*4L	AH015-4
水	LC-MS級(jí)，4*2.5L/箱	LC365

應(yīng)用編號(hào)：YB10010

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