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維生素A對人體多種器官的發(fā)育以及人體正常生理機能的維護有不可或缺的作用，然而過量攝入維生素A會引發(fā)毒副作用；維生素E作為一種抗氧化劑在體內(nèi)的主要功能是保護細胞的生物膜結(jié)構(gòu)，最近發(fā)現(xiàn)維生素E也能調(diào)控基因表達，維生素E缺乏癥雖少見，卻與新生兒發(fā)育不良和遺傳代謝病相關(guān)。因此，準確測定人體內(nèi)維生素A與維生素E具有重要意義。維生素A與維生素E由于化學性質(zhì)活潑，易被氧化，對這類物質(zhì)的準確定量具有很大的挑戰(zhàn)。

本應用案例介紹一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，采用Cleanert SLE 96孔板凈化血漿樣品，從血漿樣品中萃取富集維生素A（視黃醇，VA）、α-生育酚（α-VE）和γ-生育酚（γ-VE），實驗方法具有良好的穩(wěn)定性及可靠性，可為VA、VE臨床研究提供一種解決方案。

目標物信息

材料及儀器

Cleanert SLE 96孔板（200μL/well），Cleanert M96 生物樣品前處理儀，Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀，96孔收集板，Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm），以上產(chǎn)品均為天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品；LC-MS/MS, API 4000+（SCIEX）；VA、α-VE、γ-VE、d6-α-VE、d4-γ-VE（以上5種標準品購自altascientific）；d6-VA（購自BUCHEM BV）；甲醇；甲酸；水；異辛烷；異丙醇；2, 6-二叔丁基對甲酚。

樣品處理方法

樣品預處理

由于VA與VE穩(wěn)定性差，為防止被氧化，在實驗中需要加入抗氧化劑，所用抗氧化劑為2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）。

取100 μL血漿至潔凈樣品瓶中，加入內(nèi)標溶液，再加入50 μL異丙醇和50 μL水溶液，渦旋振蕩混勻。

SLE過程

上樣：將預混合好的溶液全部上樣，靜置5 min；

洗脫：2 mL 異辛烷/異丙醇 (9/1，含1 g/L BHT)洗脫，每次加入500 μL，分四次洗脫，合并洗脫液；最后一步洗脫結(jié)束，將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上，開啟壓力至0.005 MPa，約30 s，完全收集洗脫液。

將洗脫液在室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進行溫和氮吹干，再使用500μL 0.1%甲酸甲醇（含1 g/L BHT）復溶，進樣檢測。

儀器檢測條件

HPLC條件

色譜柱：Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm）

流速：200 μL/min

柱溫：30 ℃

進樣量：5 μL

流動相條件：100%有機相（0.1%甲酸甲醇）等度分離6min

質(zhì)譜條件

掃描模式：電噴霧電離正模式

采集模式：多反應監(jiān)測（MRM）

表1 參數(shù)信息

結(jié)果

線性范圍與靈敏度

根據(jù)目標物在人體內(nèi)的含量范圍確定標準曲線濃度范圍，試驗中使用不含目標物的血漿樣品配制7個不同濃度的校準曲線點，VA的濃度分別為：0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/mL；α-VE的濃度分別為：1、2、4、8、10、20、25 μg/mL；γ-VE的濃度分別為：0.2、0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/mL；所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進行檢測，獲得結(jié)果見表2。

表2 線性范圍及靈敏度

方法精密度與準確度

為考察方法精密度與準確度，取低、中、高三個濃度的樣本，每個濃度平行處理6個樣，獲得數(shù)據(jù)見表3.

表3 精密度與準確度

色譜圖

將經(jīng)Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進行測試，獲得譜圖見圖4-6.

血樣中大量存在的磷脂是造成液質(zhì)聯(lián)用基質(zhì)效應的主要原因，為考察Cleanert SLE技術(shù)去除磷脂的能力，特取磷脂兩對特征離子對同時進行考察：496/184，524/184，獲得譜圖見圖7.

圖4 VA血漿加標色譜圖（濃度為0.15μg/mL）

圖5 α-VE血漿加標色譜圖（濃度為2μg/mL）

圖6 γ-VE血漿加標色譜圖（濃度為0.5μg/mL）

圖7 血漿加標樣磷脂色譜圖

結(jié)論   

本應用介紹了一種簡單、高效的樣品前處理方法，通過Cleanert SLE 96孔板可高通量凈化血樣并萃取富集脂溶性維生素A與維生素E，本實驗方法易操作且穩(wěn)定，可在臨床研究及藥物代謝領(lǐng)域替代耗時、低效的液液萃取技術(shù)。

訂貨信息表

應用編號：YB10016